Інструментарій CRISPR оволодів трьома новими трюками

CRISPR, супергерой редагування генів, став трохи могутніше. Минулого тижня в Science було опубліковано три дослідження, в яких провідні лабораторії з усього світу представили новітні доповнення до цієї методики, перетворюючи редактор генів у детектива вірусів або пильного історика, який переказує всю історію клітини ДНК. Як і CRISPR, ці нові технології обзавелися кумедними акронимами: CAMERA, DETECTR і SHERLOCK. Раптовий вибух застосувань CRISPR чітко показує, що вчені вивчили далеко не всі потенційні застосування цієї технології.

Щоб перетворити CRISPR в справжній мультитул, ученим довелося умудритись: CAMERA, клітинний рекордер, використовує кільця ДНК для зчитування історії клітини – наприклад, щоб дізнатися про антибіотиках або токсини.

SHERLOCK, навпаки, додається в «жертовні» молекули РНК, які нарізаються в присутності ДНК вірусу або раку, щоб викликати позитивний сигнал. Він проявляється у вигляді синьої лінії на паперовій смужці, як в тесті на вагітність.

«Все це демонструє дуже творчі способи, до яких вдаються люди, щоб змусити працювати відкриття в області CRISPR і створити ці синтетичні шляху», говорить доктор Дейв Севідж, білковий інженер з Каліфорнійського університету в Берклі, який не брав участі в дослідженнях.

Клітинний рекордер

Чорні ящики літака є цінним ресурсом для слідчих, коли політ йде шкереберть. Точно так само вчені довгий час сподівалися винайти клітинну машину часу, яка документує події в житті клітини – дози радіації, сплески препаратів, напади внутрішньої метушні, яка призводить до погіршення самопочуття клітини.

Що може бути краще, ніж вивчити історію клітини ДНК?

Доктор Девід Лю з Гарвардського університету скористався здатністю CRISPR точно нарізати ДНК і розробив «молекулярного історика» по імені CAMERA (CRISPR-mediated analogue multi-event recording apparatus).

Ось як він працює. Для початку вчені змінюють напрямну CRISPR молекулу – «напрямну» РНК у клітинах бактерій, щоб вона спрацьовувала тільки після спуска курка: припустимо, введення антибіотика або іншої хімічної атаки. Після активації напрямна РНК виводить Cas9, ножиці CRISPR, цільове розташування. Без направляючої РНК не буде нарізки.

На додаток до модифікованої системі CRISPR команда також дала клітинам два зайвих шматочки ДНК, закодованих в круговій ДНК під назвою плазміда. Звичайно клітина экспрессирует дві плазміди з постійною швидкістю. Але як тільки активується напрямна РНК, вона (і Cas9) йде за однією з плазмід і з'їдає її, залишаючи інший недоторканим.

Отже, вчені можуть з легкістю виміряти співвідношення двох плазмід. Використовуючи цю систему, вчені змогли дізнатися, чи була клітина піддається дії тетрацикліну, відомого антибіотика.

Ця перша система працювала тільки з бактеріальними клітинами. Лю і його команда потім розробили другу методику CAMERA, яка використовує модифікований Cas9. Замість того щоб зрізати цільовий ген, ці ножиці знаходять певну букву ДНК і змінюють її на іншу.

Як і раніше, система активується тільки у відповідь на певні сигнали – препарати, поживні речовини, світло або навіть сигнальні молекули, клітини, на зразок тих, що пов'язані з раком. Рекордер не тільки записує присутність сигналу; зчитуючи частку букв ДНК, які зазнали заміні, команда також може визначити його тривалість і силу.

На відміну від клітинних рекордерів попереднього покоління, система Лю високочутлива і потребує лише десятка клітин для генерації сильного сигналу. SCRIBE, схожий рекордер, розроблений доктором Тімоті Лу в MIT ще в 2014 році, потребує «на порядок» більше клітин, щоб витягти досить слабкий сигнал.

CAMERA володіє і іншими корисними функціями. Інструмент може, наприклад, записувати кілька сигналів одночасно. Дані також можна стерти, використовуючи препарати, які повертають співвідношення плазмід до вихідного рівня.

Лу вражений. Нова робота, за його словами, «дійсно прекрасне» і «важлива». Хоча будь-яке медичне застосування потребує довгого шляху, ця система може допомогти у виявленні забруднювачів навколишнього середовища або ж відстежувати певні молекулярні сигнали, які перетворять стовбурові клітини в нейрони, м'язи або інші типи клітин.

Мисливці за вірусами

Два інших дослідження присвячені перетворенню CRISPR в чутливий діагностичний інструмент.

DETECTR використовує перевагу менш відомого побратима Cas9 – Cas12.

Як і Cas9, Cas12 слід за направляючої РНК мета і зрізає її. Але на цьому робота ножиць не зупиняється. Група під керівництвом Дженніфер Дудны, одного з винахідників CRISPR в Каліфорнійському університеті Берклі, несподівано виявила, що Cas12 залишається активним після зрізання мети – він миттєво починає полювати за одноцепочечными молекулами ДНК, намагаючись їх знищити.

Спостерігаючи за цією цікавою активністю, вчені вирішили додати молекулярні неонові сигнали в направляючу РНК, щоб вона світилася яскравим зеленим кольором після активації Cas12.

Щоб довести концепцію, вчені винайшли декілька напрямних РНК, які прив'язуються до різних штамів вірусу папіломи людини (ВПЛ), деякі з яких викликають рак шийки матки. Система DETECTR виявилася здатна виокремити два особливо небезпечних штами ВПЛ в бульйоні з різних віруснихштамів.

«Цей білок працює як надійний інструмент виявлення ДНК з різних джерел», говорить автор дослідження Дженіс Чен. «Ми хочемо розсунути межі технології, яка має потенційне застосування у будь-діагностичної ситуації, де є компонент ДНК, включаючи рак і інфекційні захворювання».

Зворотна сторона? Ненажерливість Cas12 може обмежити його використання для лікування генетичних захворювань у людей. Стартап Editas вже ліцензував Cas12 для подальшої розробки, і нова робота вчених може перешкодити його амбіційним планам.

Тим не менш скидати Cas12 з рахунків поки занадто рано. У той час як людська ДНК розмотується в одноцепочечную ДНК (і стає мішенню Cas12), цей фермент в основному зв'язується з геномної ДНК. Це обмежує його здатність полювати на потенційні одноцепочечные жертви, пояснює доктор Фен Чжн з Broad Institute, який написав роботу по SHERLOCK.

SHERLOCK, заснований на системі, вперше розробленої в 2017 році, – Specific High Sensitivity Reporter unlocking – використовує Cas13 в якості ріжучого інструменту. У Cas13 теж є режим буйства, в який він занурюється після знищення первісної мети.

У випадку з SHERLOCK Чжан і його колеги додали «жертовні» молекули РНК, які створюють сигнал після розщеплення. У присутності вірусної ДНК або РНК – наприклад, Зіку, Ебола або вірусу лихоманки денге – Cas13 кусає вірусну мішень і жертовну РНК, вивільняючи разом з тим позитивний сигнал.

SHERLOCK 2.0, про якому було розказано в Science минулого тижня, в 100 разів чутливіші оригіналу і може виявляти до чотирьох різних цілей одночасно.

Він також дуже практичний для польового використання: всі реагенти знаходяться в паперовій смузі, яка занурюється в тестовий зразок. Якщо з'являється смужка, тест позитивний – ніяких дорогих інструментів більше не потрібно.

Як і DETECTR, це робить SHERLOCK особливо корисним під час спалахів. Технологію можна легко модифікувати для відстеження інших молекул ДНК у крові, наприклад, які зазвичай пов'язані з раком або старіючими клітинами.

Разом дослідження підтверджують зростаючу дослідницьку тенденцію вивчення додатків CRISPR за межами генної терапії. Порівняно з терапією на основі CRISPR, яка вимагає багатьох років ретельної перевірки безпечності та ефективності, що ці «альтернативні» способи можуть спокійно увійти в науковий і діагностичний потік набагато швидше.

Хоча нові трюки CRISPR вимагають випробувань, експерти налаштовані оптимістично.